将预选好量程并按量程范围量好体积的水样倒入培养瓶中，在主机搅拌器上连续搅拌。并将主机和培养瓶放入培养箱中。调节培养箱内温度为20℃±1℃，待样品恒温后行五日培养。培养瓶中的水样在连续搅拌的情况下保证了足够的溶解氧供微生物行生化反应。水样中的有机物经过生物氧化作用，转变成氮、碳和硫的氧化物。在这过程中，从水样中溢出的气体二氧化碳被氢氧化钠(或氢氧化钾)吸收。此时，培养瓶中空气压力减少量，相当于微生物所消耗的溶解氧含量，即水样BOD5值与瓶中空气压力减少的程度成正比，所以BOD5的值可以由空气压力减少值来测定，增加或减少所取样品的量可以增加或降低压力减少值。这样操作者就能准确测量很宽范围的BOD5值。培养瓶中空气压力的变化是通过压力计中汞柱度的变化来行检测的，通过简单的计算即能读出水样的BOD5值。

影响BOD5测定的因素
—溶解氧：
冬季所取的样品由于试验温度设在20℃，使得溶解氧过饱和，夏季所取的样品在20℃时溶解氧可能欠饱和。在BOD5测定前应对这些样品行搅拌和曝气，以便使溶解氧调节到20℃饱和点左右。
—pH：
应调节试验水样的pH为6.7～7.5（佳点为pH 7.2），BOD5读数下降可能是由于正在试验样品的pH值出了这个范围，含有大量酸或碱的样品BOD5读数可能会低于实际含量。
酸性或碱性水样应用适当浓度的Na0H或H2S04中和。
如果工业废水中含有酸性或盐的氧化物，或者需要倍稀释，对标准五日BOD5测定，可使用pH 7.2的磷酸缓冲液作为稀释剂。
—温度：
实验时将仪器放大器放置在20℃±1℃的培养箱中。BOD的测定也能出这温度范围，例如，在35℃或37℃时，测定BOD所需要的时间可以缩短为34小时，其测定结果与五日20℃ BOD5测定相似。提温度所获得的BOD值与五日20℃条件下测定的结果有很好的相关性。
如果在采样时样品温度过20℃，或样品温度不足20℃，可将样品放在培养箱中恒温。在样品测定前要求对样品行处理。
—稀释：
直读式BOD5测定仪测定范围为0～1000mg/L。如果试验样品的BOD5估计值于1000mg/L可用稀释水稀释样品。所加入的稀释水也应保持为20℃，并曝气使氧达到饱和，如需要若干份相同的样品试验时，应稀释足够量的原水样，并从稀释样中取出与量程对应的体积。例如，当试验原水样稀释两倍时，稀释倍数为2；当原水样按1:10稀释时，则应为10，所测结果应乘上稀释倍数。
—接种：
BOD5实验要求水样含有供生物氧化的有机物和适量的氧化有机物的需氧细菌，以及吞食有机物和增需氧细菌生长的其他微生物。如果水样中根本没有或几乎没有这类微生物，就必须对水样按定比例加入这类微生物溶液。这个过程与生活污水不同，工业废水可能不含有足够量的细菌以供样品中所含有机物全的生化分解，如果所测定的样品为这种废水，应加入接种溶液。
A接种方法
制备接种溶液
接种溶液
用于接种的溶液为20℃放置24～36小时的未经处理新鲜生活污水的上清液。在下次实验中，若要使用以前测定过的水样作为接种液应经滤纸过滤，这种滤液在冷藏（约20℃）、避光的条件下保存，般在个月内是有效的。将准备测定的样品放入培养瓶中，使用吸管将定量的接种液加入到样品中（根据样品量）。按步骤测定BOD5，五日后获得的读数可以作为试验样品真实的BOD5值。
注意：当使用上述方法接种时。不必校正接种的BOD5读数。因为所加入接种液的量相对水样量来说实在太少了，以致于不影响BOD5的读数。如果上述方法未能引起水样中有机物的生物分解，可增加所加入接种液的量。如果由于接种液的加入影响了BOD5读数，可将接种液与样品同时实验行平行样测定。
接种量常取5％，10％二种
—数据处理：
对于既无稀释又无接种预处理的样品，只需将仪器上的汞压力计的读数读出，乘上所选量程的标尺系数，即得到样品BOD5值。
对于作了稀释和接种预处理的样品，可把汞压力计读数读出，样品实际BOD5按下面公式计算：
样品BOD5读数×标尺系数-接种液BOD5读数×标尺系数×接种液%
BOD5（mg/L）＝                                                     ×稀释倍数
样品液%

式中：样品BOD5读数——对应样品的汞压力计读数，厘米；
接种液BOD5读数——对应接种液的汞压力计读数，厘米；
标尺系数——根据所选量程范围从取水样量表1中查得；
接种液％——体积百分比，％；
样品液％——体积百分比，％。
例：有污水样品，估计其BOD5值过1000mg/L，因而作了稀释预处理，稀释倍数为2倍（即份样品加份稀释水）选取0～600mg/L档量程，培养五天后汞压力计读数8.8厘米汞柱。
8.8×60－0
BOD5值（mg/L）＝             ×2＝1056（mg/L）
例二：有工业废水水样估计其BOD5值约为80mg/L，现有合适的生活污水对其接种培养测定，接种量为10％（即废水水样：生活污水=9：1）
生活污水的BOD5值约在30mg/L左右，现选取0～50mg/L量程档，工业废水选取0～100mg/L量程档（取样量按说明书表1提供的各档量程取样量分别用量筒量之）平行样试验。五天后废水水样与生活污水水样汞压力读数分别为7.8厘米汞柱和4.0厘米汞柱。此种废水BOD5值为：
7.8×10－4.0×5×10％
BOD5值（mg/L）＝                     ＝ 84.4（mg/L）
90%
例三、有种工业废水有毒，估计BOD5值约700mg/L左右，测定前对样品行了10倍稀释，同时用生活污水行接种，接种液BOD5值60mg／L左右，接种量为10％，查表1，经过处理的工业废水和接种液取0～100mg／L量程档行取样试验，培养五天后汞压力计读数分别为5.2厘米汞柱和6.1厘米汞柱。此种工业废水BOD5为：
5.2×10－6.1×10×10％
BOD5值（mg/L）＝                    ×10＝510（mg/L）
90%